Site-directed mutagenesis and stability of the carboxylic acid reductase MAB4714 from Mycobacterium abscessus.

การก่อกลายพันธุ์แบบจำเพาะตำแหน่งและความคงตัวของเอนไซม์คาร์บอกซิลิกแอซิดรีดักเทส MAB4714 จาก *Mycobacterium abscessus*

Clicks: 445
ID: 97242
2019
Article Quality & Performance Metrics
Overall Quality
Not rated
Combines reader engagement with the AI quality analysis. This article has not been analysed, so there is no overall score — reader engagement is measured and shown alongside.
AI Quality Assessment
Not analyzed
Readership in this journal
Emerging

Ranked #6 of 32 articles by views in journal of biotechnology

Most read Least read

Bar heights use a square-root scale.

Mint this article as an NFT
Not yet minted

Create a permanent, verifiable on-chain record of this article on the Scimatic Network. The NFT is held in your Journament account, and you can withdraw it to your own wallet at any time.

5 SUSD one-off · no wallet required
Sign in to mint
Abstract
Carboxylic acid reductases (CARs) catalyze ATP- and NADPH-dependent reduction of carboxylic acids to corresponding aldehydes. Although successful applications of these enzymes for the bioconversion of monocarboxylic acids have already been reported, their applicability for the reduction of dicarboxylic acids is not well understood. Here, we explored the possibility of engineering CARs for enhanced activity toward succinic acid for potential applications in 1,4-butanediol production. Structural models of the carboxylate-binding pocket of the CAR enzyme MAB4714 from Mycobacterium abscessus suggested that its reactivity toward succinic acid could be enhanced by reducing the pocket volume. Using site-directed mutagenesis, we introduced larger side chains into the MAB4714 carboxylate binding pocket and compared the activity of 16 mutant proteins against cinnamic and succinic acids. These experiments revealed that, although the reaction rates remain low, the replacement of Leu284 or Thr285 with Trp increased activity toward succinic acid more than two times. The T285E mutant protein also showed increased activity toward succinic acid, but it was lower than that of T285W. The mutated residues of MAB4714 are located on the flexible loop covering the carboxylate-binding pocket, which appears to contribute to substrate preference of CARs. Thus, reductase activity of CARs against succinic acid can be improved by introducing large side chains into the carboxylate-binding pocket. We also discovered that alanine replacement of the conserved Ser713 in the CAR phosphopantetheine attachment site resulted in complete degradation of the full-length protein into separate A and R domains, suggesting that CAR phosphopantetheinylation is important for its stability in solution.
คาร์บอกซิลิกแอซิดรีดักเทส (Carboxylic acid reductases: CARs) ทำหน้าที่เร่งปฏิกิริยารีดักชันของกรดคาร์บอกซิลิกไปเป็นแอลดีไฮด์ที่สอดคล้องกัน โดยอาศัย ATP และ NADPH แม้ว่าจะมีการรายงานความสำเร็จในการประยุกต์ใช้เอนไซม์เหล่านี้เพื่อการแปรรูปทางชีวภาพของกรดโมโนคาร์บอกซิลิกแล้วก็ตาม แต่ศักยภาพในการนำไปใช้สำหรับปฏิกิริยารีดักชันของกรดไดคาร์บอกซิลิกยังไม่เป็นที่เข้าใจกันดีนัก ในงานวิจัยนี้ เราได้สำรวจความเป็นไปได้ในการวิศวกรรมเอนไซม์ CARs เพื่อเพิ่มกัมมันตภาพต่อกรดซักซินิกสำหรับการประยุกต์ใช้ในการผลิต 1,4-บิวเทนไดออล แบบจำลองโครงสร้างของช่องจับคาร์บอกซีเลต (carboxylate-binding pocket) ของเอนไซม์ CAR MAB4714 จาก *Mycobacterium abscessus* บ่งชี้ว่า ความสามารถในการทำปฏิกิริยาต่อกรดซักซินิกสามารถเพิ่มขึ้นได้โดยการลดปริมาตรของช่องจับดังกล่าว เมื่อใช้เทคนิคการก่อการกลายพันธุ์แบบเจาะจงตำแหน่ง เราได้นำสายแขนงที่มีขนาดใหญ่ขึ้นเข้าสู่ช่องจับคาร์บอกซีเลตของ MAB4714 และเปรียบเทียบกัมมันตภาพของโปรตีนกลายพันธุ์ 16 ชนิดต่อกรดซินนามิกและกรดซักซินิก การทดลองเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า แม้อัตราการเกิดปฏิกิริยาจะยังคงต่ำ แต่การแทนที่ Leu284 หรือ Thr285 ด้วย Trp สามารถเพิ่มกัมมันตภาพต่อกรดซักซินิกได้มากกว่าสองเท่า นอกจากนี้ โปรตีนกลายพันธุ์ T285E ยังแสดงกัมมันตภาพต่อกรดซักซินิกที่เพิ่มขึ้นเช่นกัน แต่มีค่าน้อยกว่าโปรตีนกลายพันธุ์ T285W กรดอะมิโนตกค้างที่กลายพันธุ์ของ MAB4714 นั้นตั้งอยู่บนลูปที่มีความยืดหยุ่นซึ่งปกคลุมช่องจับคาร์บอกซีเลต ซึ่งลูปนี้น่าจะมีส่วนช่วยในการเลือกจำเพาะต่อซับสเตรตของ CARs ดังนั้น กัมมันตภาพรีดักเทสของ CARs ต่อกรดซักซินิกจึงสามารถปรับปรุงได้โดยการนำสายแขนงขนาดใหญ่เข้าสู่ช่องจับคาร์บอกซีเลต นอกจากนี้ เรายังค้นพบว่าการแทนที่ Ser713 ซึ่งเป็นตำแหน่งที่ได้รับการอนุรักษ์ ณ บริเวณยึดเกาะฟอสโฟแพนทีทีนใน CAR ด้วยอะลานีน ส่งผลให้โปรตีนความยาวเต็มเกิดการสลายตัวอย่างสมบูรณ์แยกออกเป็นโดเมน A และ R ซึ่งชี้ให้เห็นว่ากระบวนการฟอสโฟแพนทีทีไนเลชันของ CAR มีความสำคัญต่อเสถียรภาพของเอนไซม์ในสารละลาย
Reference Key
fedorchuk2019sitedirectedjournal Use this key to autocite in the manuscript while using SciMatic Manuscript Manager or Thesis Manager
Authors Fedorchuk, Tatiana P;Khusnutdinova, Anna N;Flick, Robert;Yakunin, Alexander F;
Journal journal of biotechnology
Year 2019
DOI
S0168-1656(19)30807-7
URL
Keywords
protein stability site-directed mutagenesis carboxylic acid reductase mycobacterium abscessus succinic acid reduction

Citations

No citations found. To add a citation, contact the admin at info@scimatic.org

Comments

No comments yet. Be the first to comment on this article.