MicroRNAs (miRNAs) werden zunehmend als Onkogene oder Tumorsuppressoren beim kolorektalen Karzinom (CRC) anerkannt. Ziel dieser Studie war es, die Expression und Funktion von miR-340-5p beim CRC zu untersuchen. Die Expression von miR-340-5p in CRC-Geweben und -Zelllinien wurde mittels quantitativer RT-PCR bestimmt. Assoziationen der miR-340-5p-Expression mit klinikopathologischen Faktoren sowie dem Gesamtüberleben (OS) und dem progressionsfreien Überleben (PFS) wurden statistisch ausgewertet. Luciferase-Assays, RT-PCR und Western Blot wurden durchgeführt, um das genaue Target von miR-340-5p zu verifizieren. MTT-Assays, Koloniebildungs- und Transwell-Assays wurden eingesetzt, um die Proliferation, Migration beziehungsweise Invasion zu bestimmen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass miR-340-5p in CRC-Geweben und -Zelllinien signifikant herabreguliert war und mit dem histologischen Differenzierungsgrad (p = 0,020), Lymphknotenmetastasen (p = 0,003) sowie dem TNM-Stadium (p = 0,007) assoziiert war. Darüber hinaus ergaben Kaplan-Meier- und Log-Rank-Tests, dass Patienten mit einer geringen Expression von miR-340-5p ein kürzeres OS (p = 0,0110) und PFS (p = 0,0032) aufwiesen als Patienten mit einer hohen Expression von miR-340-5p. Zudem konnten wir nachweisen, dass Annexin A3 (ANXA3) ein direktes Target von miR-340-5p beim CRC ist. Die funktionellen Assays zeigten, dass sowohl die Hochregulierung von miR-340-5p als auch die Herabregulierung von ANXA3 die Proliferation, Migration und Invasion von CRC-Zellen hemmen können. Darüber hinaus hob die Re-Expression von ANXA3 die durch miR-340-5p induzierte Hemmung der Zellproliferation, -migration und -invasion auf. Unsere Daten belegen, dass miR-340-5p seine tumorsuppressive Funktion durch direktes Targeting von ANXA3 beim CRC ausübt, was darauf hindeutet, dass miR-340-5p einen neuartigen prognostischen Biomarker sowie ein therapeutisches Target für das CRC darstellen könnte.