parameters to evaluate the immunostimulant effect of zymosan a in head kidney leucocytes (hkl) of salmonids parámetros para la evaluación del efecto de zimosán a como inmunoestimulante sobre leucocitos de rinón cefálico (hkl) de salmónidos

The interest in characterizing fish immune responses against pathogens or discovering new immunostimulant molecules requires the use of mass screening techniques. The classical model has been the challenge in 1000 L tanks, using a high number of fishes, resulting in high economic cost. In this work, the purpose was to minimize the costs of such tests using in vitro cellular models. In primary cultures of head kidney leucocytes (HKL) immune response to Zymosan A, a type of β-glucan, was evaluated. The quantification and detection of pro-inflammatory cytokines was done based on both enzymatic activity and ELISA. The activity of phagocyte oxidase and inducible nitric oxide synthase (iNOS) was measured indirectly through NBT reduction by reactive oxygen species and Griess reaction to nitric oxide, respectively. For detecting pro-inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-6 and IL-Ιβ, monospecific antibodies generated in our laboratory were used by indirect ELISA. The immune parameters were evaluated at different concentration of Zymosan A and the evolution of the immune response over time was established. The results suggest the better time for evaluating the immunostimulant capacity of glucans and the appropriate dose of it, which is required to demonstrate the activation of macrophages (ROS and iNOS) and the production of pro-inflammatory molecules, both as indicators of good immune response. Currently, work is being conducted improving these methods, creating an ELISA sandwich and generating antibodies against total proteins of HKL for pre-absorption of induced samples. In particular, the implementation of ELISA for the characterization of cytokine secretion profiles is a biotechnological contribution in aquaculture, which has not been implemented before this work.
El interés en la caracterización de la respuesta inmune de peces contra patógenos o el descubrimiento de nuevas moléculas inmunoestimulantes, requiere el uso de técnicas de uso masivo y rápido. El modelo clásico ha sido el desafío en estanques de 1000 L, con un elevado número de peces, lo que tiene un alto costo económico. El objetivo de este trabajo fue reducir al mínimo los costos de dichos ensayos, utilizando modelos celulares in vitro. Para ello, se evaluó el efecto del inmunoestimulante de Zymosan A, un tipo de β-glucano, sobre la respuesta inmune en cultivos primarios de leucocitos de rinón cefálico (HKL), mediante la cuantificación enzimática y la detección de citoquinas pro-inflamatorias. La actividad de la fagocito oxidasa y de la óxido nítrico sintetasa inducible (iNOS), se midió indirectamente a través de la reducción de NBT, por especies reactivas de oxígeno, y la reacción de Griess para óxido nítrico, respectivamente. La detección de citoquinas pro-inflamatorias como el TNF-α, IL-6 e IL-Ιβ, se realizó mediante ELISA indirecto, con anticuerpos monoespecíficos generados en nuestro laboratorio. Los parámetros inmunológicos fueron evaluados en diferentes concentraciones y tiempos de incubación con el Zimosán A. Los resultados sugieren las condiciones óptimas para la evaluación de glucanos con capacidad inmunoestimulante, en base a indicadores de buena respuesta inmunitaria, que considera la activación de macrófagos (ROS e iNOS) y la secreción de moléculas pro-inflamatorias. Actualmente, el trabajo está dirigido a mejorar estos métodos, a través de la creación de un ELISA sandwich y generación de anticuerpos contra las proteínas totales de HKL para la pre-absorción de las muestras inducidas. En particular, la aplicación de ELISA para la caracterización de los perfiles de secreción de citoquinas es una contribución biotecnológica en la acuicultura, lo que no ha sido aplicado antes de este tipo de análisis.